Protein Analysis On Line (PAOL)

Présentation

PAOL couple une chromatographie d’exclusion et des détections en diffusion statique et dynamique de la lumière, en indice de réfraction et absorbance. PAOL allie la séparation des macromolécules et leur caractérisation. Voir le descriptif technique et scientifique. Elle permet de :

• Quantifier l’homogénéité des préparations,
• Déterminer la stœchiométrie des complexes, y compris pour des systèmes complexes associant protéine-détergent, protéine-ARN, protéine-polymère. C’est une méthode souvent appropriée pour les interactions des protéines membranaires et/ou glycosylées.

La plateforme AUC s’est engagée dans la mise en place d’une démarche qualité qui a abouti en Juin 2011 à la certification ISO 9001 (2008) et en Juillet 2015 à la certification NF X50-900 (2015).

Mots clé

Chromatographie d’exclusion haute pression, diffusion statique de la lumière, diffusion dynamique de la lumière, homogénéité, masse molaire, composition.

Effectif

• Responsable : Christine Ebel / Caroline Mas
• Opératrice : Aline Le Roy

Equipements

• Chromatographie liquide haute pression : LC20 AD (Shimadzu)
• Détecteur UV à barrette de diode : SPDM-20A (Shimadzu)
• Réfractomètre : Optilab Rex (Wyatt)
• Détecteur de diffusion statique de lumière multiangle : miniDAWN TREOS (Wyatt)
• Détecteur de la diffusion dynamique de la lumière : Dynapro Nanostar (Wyatt)
• Colonnes : KW 802.5, KW 803 et KW 804 (Shodex) ; WTC050N5 (Wyatt) ; Superdex 200 et 75, et Superose 6 10/300 GL (GE Healthcare)
• Injecteur automatique régulé en température (4-40°) (SIL-20 AC HT Shimadzu).
• collecteur régulé en température (4-20°) (FRC10A/sample cooler Shimadzu).
• Four à colonne (4-30° en conditions favorables) (XLT-01 Winsep).
• Ultracentrifugeuse Airfuge (Beckman).
• Logiciels utilisés : LC Solution (Created by Shimadzu Corporation) ; ASTRA et Dynamics (Created by Wyatt Technology Corporation).

Des tests de fiabilité sont effectués régulièrement sur les instruments :

• Chaque année : Calibration des colonnes avec protéines standard et maintenance, par les fournisseurs, pour la pompe LC20 AD (Shimadzu) et le détecteur de diffusion statique de la lumière Mini DAWN TREOS (Wyatt)
• Chaque jour d’expérience : contrôles des détecteurs (bruits, lignes de base, intensité lumineuse…)

Accessibilité

• ouvert aux académiques, qui seront formés à l’analyse des données.
• ouvert aux industriels et académiques pour la réalisation d’études et analyses.
• ouvert aux académiques et industriels sous forme de mise à disposition après formation.

Comment faire une demande ?

Tout nouveau porteur de projet doit contacter Aline Le Roy ou Christine Ebel. Chaque utilisateur s’engagera à accepter et suivre les conditions générales et les consignes d’utilisation.

Toute demande concernant la plateforme doit être accompagnée d’une demande d’analyse. Le demandeur remplit la 1ère partie, qui est complétée en concertation afin d’évaluer la faisabilité et définir la meilleure stratégie pour la conduite de l’étude, avant validation par la signature des 2 parties. Un « local contact » sera désigné et disponible pour les utilisateurs pendant la durée d’utilisation de l’équipement, pour conseils et assistance. Il est obligatoire si la réalisation de l’étude est faite par la plateforme, et conseillé aux utilisateurs même autonomes, de remplir la fiche échantillon. Si les échantillons sont envoyés, ou stockés par la plateforme, la conservation sera faite selon les conditions définies avec le demandeur dans la Fiche Echantillons (à joindre aux échantillons).

Contact et localisation

• Contacter Aline Le Roy, Christine Ebel ou Caroline Mas
• Localisation : IBS pièce 327, du lundi au vendredi, de 8h à 17h.

Echantillons

• Seuls les échantillons biologiques non pathogènes sont acceptés. Arrêté du 18 juillet 1994 fixant la liste des agents biologiques pathogènes, modifié par les arrêtés du 17 avril 1997 et du 30 juin 1998. La liste des agents biologiques pathogènes est disponible sur le site internet de l’IPBS.
• L’échantillon a typiquement une concentration de 0.5-10 mg/mL et un volume de 50 µl. Il doit être centrifugé (sur l’Airfuge : 5 min à 20 psi soit ≈ 125 000 xg) ou filtré à 0.1 µM. Les échantillons ne sont pas conservés (sauf demande express).
• Le tampon d’élution doit être filtré à 0.1µm. Il contient typiquement 100mM de sel, les colonnes de silice nécessitent un pH entre 3 et 7.5. En standard nous utilisons un tampon PBS : 100mM NaCl, 30mM Na-P, 0.3g/L NaN3 pH 6.8.

Rendu résultat

• Mise à disposition : Chaque utilisateur est en charge d’analyser ses résultats grâce aux logiciels LC Solution, ASTRA et Dynamics disponibles sur l’appareil. Une exportation de certaines analyses au format texte et tableur est possible. L’appareil PAOL est connecté au réseau interne de l’IBS pour faciliter l’impression et la sauvegarde des résultats. Chaque utilisateur doit enregistrer ses données et analyses en fin de manipulation. Les données brutes d’acquisition sont conservées pendant 3 ans sur les postes informatiques. Passé le délai de 3 ans, les données peuvent être supprimées sans préavis. L’utilisateur est responsable de l’archivage final. La plateforme n’assure pas la confidentialité des données (sauf demande express).
• Réalisation d’expériences et analyses par la plateforme : Le délai de rendu des résultats est typiquement de quelques jours. Un rapport d’expérience et analyse, vérifié par le responsable de la plateforme, est envoyé. Les résultats sont remis sous format informatique, avec l’ensemble des données nécessaires à leur exploitation. Les données sont sauvegardées et archivées pendant 3 ans.

Coûts et délais

• Académique : participation aux frais de maintenance.
• Industriel : devis sur demande.

Suivi/valorisation

• Dans le cas général, les demandeurs doivent citer la plateforme dans leurs publications en utilisant la phrase « This work used the platforms of the Grenoble Instruct-ERIC center (ISBG ; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) within the Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), supported by FRISBI (ANR-10-INBS-0005-02) and GRAL, financed within the University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). We thank Aline Le Roy, and/or Michel Thépaut and/or Christine Ebel, for assistance and/or access to the Protein Analysis On Line (PAOL) platform ».
• Le personnel de la plateforme est co-auteur s’il participe à la rédaction des articles.

Liste de nos chapitres de livres, protocoles et publications méthodologiques concernant AUC, SEC-MALS et SANS

List of publications