ANOXTAL : Cristallisation Automatisée de Protéines sous Condition Anaérobie

Présentation

Une installation permettant la cristallisation de protéines sous condition anaérobie pour leur analyse structurale. L’automatisation permet le criblage à haut débit des conditions standard de cristallisation (pour plus de détails, voir ci-dessous).

Échantillons typiques :

• Métallo-protéines sensibles à l’oxygène
• Protéines susceptibles de former des ponts disulfures par oxydation
• Protéines à chimie radicalaire

La plateforme AnoXtal est équipée de deux instruments :

• un robot de cristallisation GRYPHON (ArtRobbins Inst.) entièrement automatisé,
• un système semi-automatique de visualisation des plaques de cristallisation CrysCam (ArtRobbins Inst.).

Ce système est installé dans une boîte à gants (Jacomex) régulée à 20,5°C, sous atmosphère anaérobie.
Membre du "Partnership for Structural Biology" (PSB), nous travaillons en collaboration avec le laboratoire HTX lab de l’EMBL-Grenoble.

Mots clé

Boîte à gants, Anaérobie, Cristallisation, Robot, Nanovolume

Effectif dédié

Juan C. Fontecilla-Camps : responsable

Claudine Darnault, Lydie Martin, Xavier Vernède : gestion de la plateforme, expertise technique et scientifique, qualité, relation utilisateurs

Equipement spécifique

• La Boite à gant Jacomex :
  La boîte à gant Jacomex est une enceinte de 2m3 sur-pressurisée (entre 0.6 et 5 mBar) dont l’atmosphère est contrôlée en oxygène (<10ppm), hygrométrie (>45%) et température (20,5°C +/-0.2°C) permet de travailler dans des conditions optimales de cristallisation de protéines sensibles à l’oxygène.

• Le robot de cristallisation GRYPHON :
  Le robot de cristallisation réalise automatiquement la préparation de nano-gouttes de cristallisation dans des plaques de 96 puits, en utilisant la technique de diffusion en phase vapeur en goutte assise.
  Un total de 1250 conditions de cristallisation différentes (13 plaques de 96 puits) issues de screens commerciaux sont proposées.
  La protéine est distribuée à l’aide d’une nano-aiguille délivrant des volumes de 200 à 400 nL.
  Il est possible de tester 3 échantillons par plaque de cristallisation.
  Le temps de réalisation d’une plaque 96 puits avec 3 échantillons (288 gouttes) est d’environ 10 minutes.

• Le système de visualisation des plaques de cristallisation CrysCam :
  Les plaques de cristallisation sont stockées dans la boîte à gants en anaérobie à environ 20°C. Le système de visualisation réalise la lecture semi-automatique des gouttes dans les plaques de cristallisation.
  La lecture des plaques a lieu aux jours (J) 1 (+1), J3 (+/-1), J7 (+/-2), J15(+/-3), J32 (+/-4), puis 2 à 3 mois après la formation des gouttes. Des temps de lecture différents peuvent être envisagés. Merci de nous le signaler dans le formulaire, au moment de la première demande.
  Les images aux jours (J) 3 (+/-1), J7 (+/-2), J15 (+/-3), J32 (+/-4) , puis 2 à 3 mois après la formation des gouttes seront envoyées aux utilisateurs par système d’envoi de gros fichiers sécurisé (à télécharger dans les jours qui suivent l’envoi du lien par courriel).
  Les plaques seront conservées 2 à 3 mois après la formation des gouttes dans la boîte à gants et les images ne seront pas stockées par la plateforme.

Conditions de cristallisation proposées

Kits de cristallisation disponibles sur la plateforme :

• 1- Crystal Screen I / Crystal Screen II (HAMPTON)
• 2- Crystal Screen Lite / Crystal Screen Peg-ion (HAMPTON)
• 3- Crystal Screen MembFac / Crystal Screen Natrix (HAMPTON)
• 4- Crystal Screen Ammonium Sulfate/Screen Malonate/ Quick Screen/ NaCl (HAMPTON)
• 5- PEG 6000 / et MPD / BASIC 3 / PEG LiCl (HAMPTON et JENABIOSCIENCE POUR BASIC3)
• 6- INDEX (HAMPTON)
• 7- SALT RX I /II (HAMPTON)
• 8- WIZARD I / II (JENA BIOSCIENCE)
• 9- THE PEG (PEG SUITE) (QIAGEN)
• 10- JCSG + (QIAGEN)
• 11- PACT (QIAGEN)
• 12- ANION SUITE (QIAGEN)
• 13- CATION SUITE (QIAGEN)

Vous trouverez plus de détails sur la répartition de ces kits dans les plaques de cristallisation et sur les conditions de cristallisation en cliquant :

• sur ce lien pour les plaques 1 à 6 (cliquer sur le nom de la plaque ou le numéro de puit pour avoir le détail).
• sur les numéros, pour les plaques 7, 8, 9, 10, 11, 12 et 13.

Coût

Merci de contacter Juan C. Fontecilla-Camps

Localisation

Institut de Biologie Structurale, pièce 268.

Comment faire une demande ?

Merci d’utiliser le formulaire de demande d’analyse téléchargeable sur le lien suivant.

Échantillons (à fournir par le demandeur)

Toutes les informations concernant vos échantillons doivent être mentionnées dans le formulaire de demande d’analyse.
La qualité de l’échantillon doit être approuvée par l’opératrice.
Pour toute demande, sont requis :

• une photo d’un gel d’électrophorèse SDS/PAGE
• le profil de chromatographie de la dernière étape de purification

Caractéristiques des échantillons :

Il est possible de tester de un à trois échantillons par plaque de cristallisation.
Les échantillons traités par la plateforme doivent :

• être solubles (non précipités, non agrégés).
• être livrés dans un tampon faiblement concentré (50mM maximum) et de faible force ionique si la présence d’un sel est requise.
• être clairement identifiés :
  « Nom de l’utilisateur, nom de l’échantillon, concentration de la protéine (mg/ml), volume, date d’envoi ».
  Nous conseillons la concentration la plus élevée à laquelle la protéine reste soluble dans son tampon.

Filtration  :

Sauf avis contraire de votre part, les échantillons seront filtrés par nos soins (Ultrafree-Millipore 0,45µm) avant cristallisation. Merci de préciser dans le formulaire de demande d’analyse si votre échantillon ne peut pas être filtré.

Volumes d’échantillons requis :

En plus du volume théorique nécessaire à l’élaboration d’une plaque, nous avons besoin de 20µL supplémentaires d’une part pour la filtration de l’échantillon et d’autre part pour garder une marge de sécurité relative au fonctionnement du robot.

Ces volumes s’entendent pour 1 échantillon par plaque.
Exemple : pour un échantillon, une plaque et des gouttes de 200nL, 50µL de solution protéique sont requis.

Stockage des échantillons :

A réception, le ou les échantillons seront stockés dans les conditions définies lors de la demande :

• en boîte à gants sous atmosphère anaérobie, soit à 20°C, soit à 4°C
• congelés à -20°C
• congelés à -80°C
• congelés dans l’azote liquide.
  L’utilisateur ne doit pas envoyer plus d’échantillon que la quantité nécessaire aux expériences. Tout éventuel surplus sera détruit.

Adresse d’envoi des échantillons  :

A l’attention de Juan C. FONTECILLA-CAMPS
PLATEFORME ANOXTAL
IBS/METALLO
EPN Campus
71, avenue des Martyrs
38044 GRENOBLE CEDEX 9
FRANCE

Pour l’envoi, la plateforme déconseille l’utilisation de carboglace et recommande l’utilisation de système « dry-shippers » dans le but d’assurer une bonne livraison de l’échantillon protéique. Pour une bonne réception, merci de prévenir Juan Fontecilla-Camps du jour de l’envoi.

Rendu des résultats

• Prestation n°1 : fichier de photos : un dossier contenant les photos des gouttes est envoyé après visualisation
• Prestation n°2 : prestation n°1, avec des prises de vues à plus fort grossissement possibles sur demande
• Prestation n°3 : prestation n°2 avec aide à la lecture des données, interprétation et rapport.

En cas d’obtention d’un cristal, la plate-forme fournit toutes les conditions qui ont permis cette obtention, sans pour autant garantir que le cristal pourra être reproduit ailleurs.

Délai moyen entre demande et prestation

De 2 semaines à 3 mois en fonction de la demande ; ces délais sont précisés au moment la commande.

Remerciements

La direction de l’IBS souhaite que l’on remercie les plateformes pour leur implication dans les projets de recherche.
"This work used the platforms of the Grenoble Instruct-ERIC center (ISBG ; UAR 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) within the Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), supported by FRISBI (ANR-10-INBS-0005-02) and GRAL, financed within the University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003)."
We thank C. Darnault, J.-C. Fontecilla, L. Martin, X. Vernede and Laura Zeppieri from the IBS platform "AnoXtal" for the “anaerobic crystallization assay experiments”.