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ESPRITIntroductionIl n’est pas rare de travailler sur des protéines ayant très peu d’informations précises sur leurs éventuels domaines en biologie structurale. Il est difficile de concevoir des constructions exprimées et soluble avec des rendements conséquents lorsque la protéine entière ne peut être exprimée ou encore sur une approche focalisée sur les domaines. Certaines protéines ne partagent aucune similitude avec d’autres, ce qui entrave l’identification de domaines par alignements de séquences multiple. Souvent, des annotations sur des caractères fonctionnels existent (mutagénèse, délétions) mais malheureusement ces régions ne permettent pas de bien définir les bornes structurales des constructions. De même, des extrémités désordonnées peuvent conduire à des infructueuses tentatives de cristallisation à partir d’une construction soluble. ESPRIT permet de maitriser ces problèmes par une banque aléatoire de concert avec un criblage à haut débit automatisé. PresentationUne stratégie optimale est définie à l’issue d’une discussion entre notre expertise en criblage de la plateforme et la connaissance de l ; utilisateur vis-à-vis de la protéine. La génération de la banque de constructions ainsi que le criblage s’étend sur environ 5 semaines qui impliquent potentiellement une participation de l’utilisateur sur les dernières étapes du criblage. Mots clefsExpression de protéines solubles, détermination des bornes de domaines, évolution dirigée, banque de clones aléatoire Vue d’ensemble de la technologie ESPRIT1er étape : La banque de clones tronqués de façon aléatoire par l’exonuclease III permet de générer toutes les extrémités des bornes des domaines pour le criblage.
2eme étape : Jusqu’à 28000 constructions sont isolées dans des plaques 384 puits grâce a un robot « Picker-gridder »
3eme étape a : (effectue pendant la visite de l’utilisateur) les clones sont imprimes sur une membrane de nitrocellulose. Puis, ces derniers sont analyses à travers leur niveau d’expression ; et la biotynilation in vivo sert de marqueur de solubilité
3eme étape b : Les clones présentant à la fois une expression par l’étiquette N-ter 6xHis et une solubilité par biotinylation de l’étiquette C-ter biotin acceptor peptide sont sélectionnés par fluorescence.
4eme étape : 96 clones positifs sont sélectionnés grâce à une analyse statistique. Ces clones sont induits en culture liquide de 4 ml dans des plaques 24 puits suivi d’une purification NiNTA en plaque 96 puits par centrifugation. Puis les échantillons sont séparés par SDS_PAGE et enfin transférés par WB. Enfin, les protéines sont révélées par fluorescence. Cette étape permet de confirmer l’expression et la solubilité de ces clones.
Les étapes 1 et 2 sont réalisées préalablement sur la plateforme avant la visite de l’utilisateur. Puis, pendant la visite, l’utilisateur peut assister aux étapes 3 et 4 ContactIngenieur plateforme : Philippe Mas Equipement specifique2 robots Kbiosystem picker-gridder AccesLes projets académiques peuvent être présentés à Instruct pour le financement des couts de consommable et de visite (voyage et hôtel). Sinon, les projets peuvent être directement facturés à l’ISBG CoutLes couts de consommable est dans la fourchette 1000 à 1500 euros par criblage (selon la stratégie). N’hésitez pas à nous contacter pour que nous puissions définir une stratégie ou d’éventuels options de financement Websitehttps://www.structuralbiology.eu/up... La plateforme ESPRIT est gérée et hébergée à l’EMBL et décrite ici Publications1. Hart DJ, Waldo GS (2013) Library methods for structural biology of challenging proteins and their complexes. Curr. Opin. Struct. Biol. 23:403–408. |
